ВСЕРОСИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНЕВОДСТВА

Использование микросателлитных маркеров ДНК в контроле происхождения лошадей

м.н.с. лаборатории иммуногенетики Зайцева М.А.

Повышение эффективности контроля происхождения племенных лошадей - одна из важнейших задач племенного коневодства. В современных условиях в связи с появлением большого числа частных владельцев, высокой стоимостью племенных животных, увеличением экспорта и импорта, участием в международных соревнованиях, а также применением биотехнологических методов при воспроизводстве необходимость надежной системы идентификации и контроля происхождения лошадей становится особенно актуальной. Причины, обуславливающие ошибки в документах лошадей, могут быть самыми разными (покрытие кобылы двумя жеребцами, случайные спаривания, небрежность при описании отметин и таврении, умышленная фальсификация). На сегодняшний день единственным эффективным способом контроля достоверности происхождения и идентификации лошадей является генетическое тестирование, основанное на использовании явления генетического полиморфизма.

Открытие множественного аллелизма систем эритроцитарных антигенов, белков и ферментов крови в 60-80-х гг. прошлого века положило начало широкому применению метода генетического маркирования племенного поголовья лошадей в большинстве стран мира с традиционно высоко развитым коневодством. Уже в самом начале внедрения метода были получены данные, свидетельствующие, что использование только одной генетической системы - трансферрина позволяет уточнить происхождение лошадей в 30% случаев (A. Baer, 1967), а при совместном использовании систем трансферрина и альбумина этот показатель повышается до 51%, использование трех электрофоретических систем (Al, Es, Tf) - 51,4-71,7%, по шести системам, включая группы крови - 80,5-96,6%, в зависимости от генетической структуры исследуемой породы или внутрипородной группы (Р.М. Дубровская и др., 1976). Однако, было обнаружено, что целый ряд генетических систем групп крови и белков у некоторых пород лошадей (и особенно у высококультурных пород с международным распространением) обладает пониженным уровнем полиморфизма, что значительно снижает уровень достоверности контроля. Эта ситуация осложняется и тем, что при современных методах селекции практически во всех породах при проведении генетического мониторинга наблюдается общее снижение уровня полиморфизма традиционных генетических систем, вплоть до исчезновения редких аллелей, являющихся наиболее эффективными маркерами.

Все это обусловливает необходимость внедрения в практику коневодства новых технологий, основанных на применении микросателлитных маркеров ДНК. Исследования полиморфизма ДНК лошадей, как и других биологических объектов, проводились в трех направлениях - исследование случайно амплифицированных фрагментов ДНК (RAPD-PCR), исследование рестрикционных фрагментов ДНК (наиболее часто называемое первоначальным терминов “ДНК-фингерпринтинг”) и изучение полиморфизма микросателлитных фрагментов ДНК (в последнем случае можно говорить о разделение на исследование последовательностей геномной и митохондриальной ДНК). Первые два метода традиционно мало использовались для проведения контроля происхождения лошадей (RAPD из-за слабой воспроизводимости при межлабораторных сравнительных испытаниях, а фингерпринтинг - из-за высоких финансовых и временных затрат и необходимости индивидуального аналитического подхода практически в каждом случае). Наиболее часто для генетической экспертизы и проведения контроля достоверности происхождения используются микросателлитные маркеры.

Микросателлиты (STR, Short Tandem Repeats) - это короткие, последовательно расположенные повторы, которые являются удобными генетическими маркерами из-за относительно несложной методики определения, высокого уровня полиморфизма и стабильного аутосомного кодоминантного наследования. Основными требованиями к микросателлитным локусам являются: высокий уровень полиморфизма, подходящий размер аллеля, низкая степень мутаций, «работоспособность» праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР), отсутствие нулевого аллеля и генетическая независимость от других локусов (E. Bailey et.al., 1998). Получение информации о структуре микросателлитных последовательностей получают двумя способами - молекулярным клонированием в бактериальной культуре с последующим скринингом или после выделения интересующих фрагментов, полученных в ходе RAPD-ПЦР с последующим сиквенсом и подбором фланкирующих праймеров. После ПЦР со специфическими праймерами, в ходе которой количество исходных участков-матриц увеличивается в сотни тысяч и миллионы раз, образуются фрагменты ДНК разной длины (измеряющейся в парах азотистых оснований ДНК, bp), которые визуализуются после электрофоретического разделения. В последнее десятилетие окрашивание фрагментов не применяется, и визуализация происходит путем использования меченных флуоресцентными метками праймеров с последующим спектрографическим лазерным анализом. Длины аллелей микросателлитов, использующихся для контроля происхождения лошадей, представлены в таблице 2, при этом необходимо отметить, что современные методы позволяют разделить фрагменты, различающиеся всего на одну пару азотистых оснований. Для удобства работы при обработке данных и унификации при сравнении результатов, полученных в разных лабораториях, было введено буквенное обозначение аллелей микросателлитов по аналогии с таковым у аллелей белков и ферментов крови лошадей.

Подбор локусов микросателлитов во многом зависит от целей, которые ставит перед собой исследователь. Контроль происхождения и генетическая идентификация не являются единственным приложением метода. Полиморфизм локусов микросателлитов успешно применяется при проведении генетического мониторинга пород и популяций лошадей и при изучении межпородной дифференциации. Так, например локус VHL20 показал значительную “нейтральность” по отношению к действию искусственного отбора, то есть его аллельное распределение существенно не отличалось у далеких относительно друг друга пород, поэтому не был рекомендован для использования в исследованиях межпородной дифференциации, однако он вполне успешно может работать при проведении контроля происхождения. В целом необходимо отметить, что подбор локусов зачастую приходится проводить эмпирически, в зависимости от генетической структуры исследуемой выборки. Однако, Международным обществом по изучению генетики животных предложены панели локусов микросателлитов для основных видов сельскохозяйственных, домашних и одомашненных животных, в которые включены наиболее информативные локусы, использующиеся при контроле достоверности происхождения (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика панелей микросателлитов, рекомендованные ISAG для животных (на 01. 01. 2004 г.)

Вид животных

Число локусов микросателлитов

Особенности ПЦР

Лошадь

9 основных, 6 дополнительных (A.T. Bowling, 1998)

Две мультиплексные реакции

КРС

9 основных, 5 дополнительных

Две мультиплексные реакции

Собака

Две мультиплексные реакции

Овца

Три мультиплексные реакции

Коза

Три мультиплексные реакции (1 аналогична ПЦР для овец)

Свинья

Две мультиплексные реакции

Первые исследования, касающиеся возможности применения метода определения полиморфизма микросателлитов в контроле достоверности происхождения лошадей начались в начале 90 гг. прошлого века, и практически сразу микросателлитные маркеры показали высокую эффективность в контроле происхождения лошадей. При использовании общей панели генетических систем крови (7 групп крови, 16 локусов белков и ферментов и 8 локусов микросателлитов) эффективность контроля происхождения повышается до 99,9% (S. Marklund et.al., 1994). В то же время было предложено использование мультиплексной полимеразной реакции и автоматизация считывания результатов электрофоретического разделения, позволяющие значительно сократить время анализа и повысить достоверность данных исследования.

В настоящее время в теоретической и прикладной генетике лошади используется огромное количество локусов микросателлитов (M. L. Eggeleston-Stott et.al., 1996,1999, D. F. Antczak, 1999, G. Lindgren et.al., 1999, Kakoi T. Et.al.,1999,2000,Tozaki S. et.al., 2000), однако только наиболее информативные и обладающие стабильным наследованием без проявления эффекта “нулевых” аллелей были отобраны комитетом Международного общества по изучению генетики животных в панель, применяющуюся при контроле происхождения. Известно более 300 локусов микросателлитов и RAPD-маркеров, не включенных в упомянутую панель, но эффективно применяемых в исследованиях, направленных на изучение генома лошади и его картирование.

Однако основным приложением изучения полиморфизма микросателлитов ДНК в практическом коневодстве является контроль происхождения племенных животных. А.Т. Bоwling писала, что начало использования ДНК-технологий в контроле происхождения является революционным этапом (Bowling A.T., 1996, 2000). Сравнение эффективности 9 локусов микросателлитов с 11 локусами белков и ферментов крови показало, что ДНК- маркеры обладают заметным преимуществом при проведении контроля происхождения лошадей чистокровной верховой и арабской пород Польши (Gralak B. et.al., 1998). Высокий полиморфизм использующихся локусов позволяет эффективно проводить контроль по одному из родителей, что зачастую было невозможно при использовании генетических систем групп крови, белков и ферментов (M. Ron et al, 1993).

Для лошадей панель микросателлитов, включающая 12 локусов, была предложена в 1996 году, с тех пор она претерпела незначительные изменения, связанные с исключением наименее информативных локусов и рекомендацией новых, обладающих высоким уровнем полиморфизма. В таблице 2 представлена характеристика наиболее часто употребляемых (и употреблявшихся) в контроле достоверности происхождения лошадей локусов микросателлитов.

Таблица 2

Характеристика локусов микросателлитов, рекомендованных ISAG для проведения контроля достоверности происхождения лошадей с 1996 по 2004 гг.

Локус

Количество аллелей

Длины фрагментов, bp/
M value

Метка праймера, DYE

Литературный источник

AHT4

9

146-170/158

FAM

Binns et al, 1995

AHT5

8

129-149/138

JOE

-//-

ASB2

17

220-240/244

JOE

Breen et al, 1997

HMS2

218-238/

TAMRA

Guerin et al, 1994

HMS3

10

149-172/160

TAMRA

-//-

HMS6

6

157-169/163

JOE

-//-

HMS7

6

172-180/179

FAM

-//-

HTG4

7

120-140/133

FAM

Ellegren et.al, 1992

HTG6

8

80-107/96

JOE

-//-

HTG7

5

118-130/124

TAMRA

Marklund et al, 1994

HTG10

7

92-112/101

TAMRA

-//-

VHL20

10

86-105/97

FAM

Van Haeringen et al, 1994

HMS1*

6-7

170-180/181

-//-

Guerin et al, 1994

LEX3*

-

-/210

-//-

Coogle et al,

1996

LEX33*

-

-/207

-//-

-//-

Изменения в приведенной панели происходят и в настоящее время. Так, в 9 лабораториях США панель включает всего 9 из упомянутых 12 локусов, обязательных для проведения генетической экспертизы (табл. 1, 2), однако, при необходимости проведения дополнительных исследований возможно включение 6 дополнительных локусов. В то же время, официально рекомендованный ISAG коммерческий набор реактивов для проведения контроля происхождения лошадей с 2004 года дополнился еще 5 парами праймеров, таким образом, предлагаемая панель стала включать 17 локусов микросателлитов ДНК. Кроме того, ведущие лаборатории мира вправе оставлять в своей панели микросателлиты, открытые их сотрудниками, если они считают, что на конкретном конском поголовье определенных стран их эффективность не уступает общепринятым локусам.

Необходимо отметить, что по аналогии с генетическими системами белков и ферментов крови число аллелей каждого локуса микросателлитов может довольно сильно отличаться у пород лошадей разного происхождения. Это зачастую обусловливает необходимость индивидуального подхода к выбору локусов микросателлитов для анализа. Допускается полностью исключать из панели малоинформативные локусы, проявляющие низкий уровень полиморфизма у конкретных пород лошадей.

Успешное картирование генома лошади позволило на новом уровне изучать явление сцепленного наследования маркерных генов и генов, обуславливающих наследственные заболевания и хозяйственно-полезные признаки лошадей. Установлено, что локусы микросателлитов HTG4 и HTG8 сцеплены с геном, обуславливающим синдром врожденного иммунодефицита лошадей (SCID), который может передаваться потомкам от родителей-гетерозигот (Bailey E. et.al., 1997, Shin E.K. et.al., 1997). При этом один из этих локусов не входит в панель, рекомендованную для проведения контроля достоверности происхождения. Обнаружение гетерозиготных носителей этого заболевания проводится также с помощью полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами (D. Bernoco, E. Bailey, 1998). Известно о сцепленном наследовании ряда локусов микросателлитов и генов, регулирующих экспрессию пигментов, определяющих масти лошадей, что позволяет получать животных желаемой масти.

По прошлогодней рекомендации International Stud Book Committee (ISBC) все действующие лаборатории, занимающиеся проведением контроля достоверности происхождения и идентификацией племенных лошадей, должны проводить тестирование по 15 маркерным локусам, рекомендованным Международным обществом по изучению генетики животных. Тем лабораториям, которые перешли на типирование крови по локусам ДНК, комитет рекомендует продолжать проводить анализ 8 полиморфных систем крови, включая 6 систем белков и 2 системы групп крови (D и K). Комитет обращает внимание на то, что контроль происхождения на уровне ДНК является более эффективным, чем контроль на уровне белков и групп крови. Всем лабораториям настоятельно рекомендуется внедрять использование ДНК-типирования как можно скорее.

Для унификации результатов ДНК-анализа Международным обществом по изучению генетики животных (ISAG) с 1997 года рекомендовано использование автоматических секвенаторов, позволяющих проводить фрагментный анализ ДНК на уровне, практически недоступном при использовании рутинных методов (по сути, в развитых странах использование секвенаторов уже считается рутинным методом). Автоматизация процесса позволяет практически полностью исключить субъективные ошибки исследователя, в основном возникающие при считывании результатов после электрофореза. Использование стандартизированных наборов для выделения, очистки, амплификации и электрофоретического разделения позволяет максимально унифицировать методику анализа и облегчает сравнение результатов между лабораториями. По сути, единственным фактором, который может оказать влияние на результат анализа, становится качество ДНК (при условии высокой квалификации персонала). В некоторых зарубежных лабораториях принята практика выделения ДНК лошадей из волосяных луковиц как биологическим материалом, однако это возможно только при наличии специального оборудования для выделения (концентраторов) и очистки ДНК.

Список литературы:

1. Bailey Е., Reid R.C., Skow L.C., Mathiason K., Lear T.L., McGuire T.C. Linkage of the gene for equine combined immunodeficiency disease to microsatellite markers HTG8 and HTG4; Synteny and FISH mapping to ECA9./ Animal Genetics, 1997, 28, 268-273
2. Bowling A.T. DNA tests for parentage verification in horses// Animal Genetics, ?
3. A R Caetano, D F Antczak. Equine dinucleotide repeat loci COR001-COR020.//Animal Genetics, 1999, 30, 225
4. L Coogle, E Bailey. Equine dinucleotide repeat loci LEX049 - LEX063.// Animal Genetics, 1997, 28, 378
5. M L Eggleston-Stott, A Del Valle, A.T. Bowling, M Bautista, R. Zahorchak, W. Malyi. Four equine dinucleotide repeats at microsatellite loci UCDEQ5, UCDEQ14, UCDEQ46, UCDEQ62.// Animal Genetics, 1996, 30, 2, 129
6. M L Eggleston-Stott, A Del Valle, M Bautista, S Dileanis, E Wictum., A.T. Bowling Nine equine dinucleotide repeats at microsatellite loci UCDEQ136, UCDEQ405, UCDEQ412, UCDEQ425, UCDEQ437, UCDEQ467, UCDEQ487, UCDEQ502 and UCDEQ505.// Animal Genetics, 1999, 30, 69
7. M L Eggleston-Stott, A Del Valle, M Bautista, S Dileanis, E Wictum. Twelve equine dinucleotide repeat at microsatellite loci UCDEQ304, UCDEQ380, UCDEQ387, UCDEQ411, UCDEQ439, UCDEQ440, UCDEQ455, UCDEQ457, UCDEQ464, UCDEQ465, UCDEQ482 and UCDEQ497.// Animal Genetics, 1999, 30, 69
8. Gralak B., Kuril J., Lukaszewicz M., Zurkowski M. Applicability of nine microsatellite DNA sequences vs eleven polymorphic blood protein and enzyme systems for the parentage control in Polish Arabian and Thoroughbred horse./ Animal Science Papers and Reports.1998. Vol. 16. No 4. P. 209-218
9. Kakoi T. Tozaki, K. Hirota, S. Mashima. Genetic polymorphism of equine microsatelite loci: TKY16, TKY19 and TKY21.// Animal Genetics, 1999, 30, 68
10. Kakoi, T. Tozaki, K. Hirota, S. Mashima, M. Kurosawa, M. Miura Ten equine microsatelite loci: TKY25, TKY26, TKY27, TKY28, TKY29, TKY267, TKY268, TKY269, TKY270 and TKY271 // Animal Genetics, 2000, 31, 1, 68
11. G Lindgren, H Persson, H Ellegren. Five equine dinucleotide microsatellite loci HTG17, HTG20, HTG21, HTG28 and HTG31. // Animal Genetics, 1999, 30, 70
12. Mashima, H. Kakoi, T. Tozaki TKY101: a highly polymorphic equine dinucleotide repeat locus./ Animal Genetics, 1999, 30, 163
13. S Marklund, H Ellegren, S Eriksson, K Sandberg, L Andersson. Parentage testing and linkage analysis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites.//Animal Genetics, 1994, 25, 19-23
14. Shin E.K., Perryman L.E., Meek K. Evaluation of a test for identification of Arabian horses heterozygous for the severe combined immunodeficiency trait//JAVMA, 1997, vol. 211, No 10, 1268-1270
15. Tozaki S. Inoue, S. Mashima, M. Ohta, N. Miura, M. Tomita Sequence analysis of trinucleotide repeat microsatellites from an enrichment library of the equine genome// Genome, 2000, 43, 354-365

МАРКЕР-ВСПОМОГАТЕЛЬНАЯ СЕЛЕКЦИЯ В КОНЕВОДСТВЕ
Л.А. Храброва, канд. с.-х. наук, ВНИИ коневодства

В последнее десятилетие в области фундаментальной и прикладной генетики животных выделилось новое направление, которое получило название маркер-вспомогательная селекция.
Открытие наследственного полиморфизма белков, ферментов и групп крови у разных видов сельскохозяйственных животных явилось мощным стимулом для изучения генетических особенностей пород и возможностей использования маркерных генов в практической селекции. К настоящему времени благодаря быстрому внедрению ДНК-технологий общее число определяемых у лошадей маркерных генов уже достигло нескольких десятков, что позволяет надежно контролировать значительную часть ее генома.
Генетические маркеры оказались незаменимым материалом для выявления диапазона популяционной и видовой изменчивости, изучения филогенеза, степени генетического сходства и последующей микроэволюции. пород животных. Данные ФАО по оценке сохранности пород сельскохозяйственных животных свидетельствуют, что задача рационального использования и сохранения генетических ресурсов, ведения систематического генетического мониторинга особенно актуальна в коневодстве.
Важнейшей проблемой повышения эффективности совершенствования пород является изучение генетических детерминант формирования высокой продуктивности и использования генетического мониторинга при управлении селекционным процессом. Многовековая практика ведения животноводства выработала различные методы создания и улучшения пород, суть которых сводится к выявлению и интенсивному использованию животных с желательными признаками. Такой подход достаточно долго обеспечивал эффективность селекционного процесса, и многие селекционные программы по совершенствованию пород, типов и линий животных разработаны на данной основе. Однако становится все более очевидным, что одни лишь традиционные методы разведения не могут обеспечить ощутимого селекционного прогресса в породах, более того, остро встает вопрос о снижении воспроизводительных качеств, жизнеспособности и устойчивости к заболеваниям.
Селекционерам хорошо известно, что чем выше продуктивность животных, тем труднее достичь селекционных сдвигов. Это происходит потому, что интенсивная селекции приводит, с одной стороны, к повышению продуктивности, с другой - к снижению генетического разнообразия и накоплению сопряженного генетического груза. Уменьшение резерва генетической изменчивости может привести к потере адаптивных качеств животных и застою в селекции.
Современные генетические подходы к совершенствованию пород основаны на более полной оценке генотипа животных и генетического разнообразия популяций с помощью маркерных технологий, таких как маркер-вспомогательная селекция (Marker-assisted selection), контроль происхождения и интрогрессия (межвидовой перенос генов). Использование маркерных генов для генетической экспертизы происхождения лошадей уже вошло в практику коннозаводства многих стран и стало обязательным элементом племенной работы с заводскими породами лошадей, в том числе и в нашей стране. На сегодня наиболее актуальной задачей является изучение возможностей использования маркер-вспомогательной селекции в коневодстве и внедрения результатов научных исследований в практику племенной работы.
Многочисленные исследования полиморфизма белков ферментов и систем крови лошадей у нас в стране (Дубровская Р.М., Стародумов И.М., 1976, 1986. 1992; Храброва Л.А., 1980; Шемарыкин Е.И., 1981, Глазко В.И. и др., 1996, 1999; Тихонов В.Н., 1998 и др.) и за рубежом (Stormont e. a., 1965; Sandberg, 1968, 1973; Scott, 1970; Glasnak e.a., 1973; Podliachouk e.a., 1975; Nozawa e.a., 1976; Bowling, Clarк, 1985; и др.) доказали существование выраженного внутривидового разнообразия по целому ряду локусов структурных генов (AlB, Ca, Cat, Cp, Es, 6-PGD,Pi, Tf) и семи системам эритроцитарных антигенов (A, C, D, K, P, Q, U). Более низкий уровень полиморфности у лошадей был отмечен в локусах ферментов - кислой фосфатазы (AP), НАДФ-диафоразы (DIA), глюкозофосфат изомеразы (GPI) и фосфоглюкомутазы (PGM).

Таблица 1.

Частоты встречаемости аллелей трансферрина у лошадей заводских пород.

Межпородные различия по частотам встречаемости аллелей и типов систем крови, а также степени гетерозиготности и уровню полиморфности исследуемых локусов оказались наиболее выраженными между лошадьми разного направления продуктивности и происхождения. Как и следовало ожидать, самый высокий уровень полиморфности исследованных локусов был отмечен у аборигенных пород лошадей, хорошо приспособленных к существованию в природных условиях: исландских и шетлендских пони (Hesselholt, 1966; Buis, 1976), якутской (Гурьев И.П., 1990). мезенской (Юрьева И.Б., 2000), вятской (Храброва Л.А., Зайцев А.М., 2000). Среди заводских пород наибольшей гетерогенностью структурных генов и систем крови выделяются тяжелоупряжные лошади - ардены, брабансоны, клейдесдали, першероны (Bengtsson e.a., 1968; Kaminski e.a., 1976; Bouquet e.a., 1977), а также владимирские, русские и советские тяжеловозы (Дубровская Р.М. и др., 1992). Для генетической структуры многих тяжелоупряжных пород лошадей типична высокая частота встречаемости "медленных" аллелей трансферрина Tf H, Tf O и Tf R, а также группы крови Ddghm.
Самый низкий уровень полиморфности по всем изученным локусам был зарегистрирован у лошадей чистокровной верховой породы (Дубровская и др.. 1992; Kaminski e.a., 1976; Bowling, Clark, 1985; Niemczewski, Zurkowski, 2000) При этом популяции чистокровных верховых лошадей разных стран очень незначительно различались по частотам полиморфных систем крови (Табл. 1). Очевидно, что закрытая система студбука и длительная селекция по резвости способствовали высокой степени консолидации генофонда этой породы.
Вторая чистокровная порода лошадей мирового разведения - арабская - также устойчиво сохраняет оригинальный генетический профиль, несмотря на специфику разведения арабских лошадей в разных странах. В отличие от других верховых, а также рысистых и тяжелоупряжных пород у арабских лошадей отсутствует аллель Tf R и ряд аллелей D системы групп крови, характерных для полукровных, упряжных и локальных пород.
Наша отечественная призовая порода лошадей - орловский рысак - по своей генетической структуре заметно отличается от всех других рысистых пород, и особенно существенно от американского рысака. Характерной особенностью орловского рысака является сравнительно высокая частота встречаемости аллелей TfH, TfR, а также EsG. Анализ аллелофонда орловской рысистой породы по изученным локусам свидетельствует о ее более тесных связях с европейскими упряжными лошадьми. По-видимому, сложившиеся характерные особенности породы поддерживаются стабилизирующим отбором, что подтверждает постоянство генетической структуры популяции на протяжении последних двух десятилетий (Храброва Л.А.. 1980; Масасина Е.В. и др.. 2000). В отличие от других призовых пород для орловского рысака характерны высокий уровень полиморфности и гетерозиготности исследованных локусов и соответственно большой резерв генетической изменчивости, а также хорошие адаптивные качества.. Недавно проведенное генетическое тестирование всего племенного ядра этой породы (п=1254) показало, что все обследованные заводские популяции имеют типичные для породы аллели, но различаются по частоте встречаемости типов и генов отдельных локусов. Наиболее существенные различия были выявлены между орловскими рысаками разных заводских типов (Масасина Е.В. и др., 2000).
Анализ многочисленных литературных данных свидетельствует, что генные частоты могут служить характеристикой не столько отдельных пород, сколько хозяйственных типов лошадей (Роdliachouk e.a., 1975) Действительно, по распределению большинства аллелей полиморфных систем крови рысаки занимают промежуточное положение между лошадьми верховых и тяжелоупряжных пород. Известно, что на первых этапах в создании породы, как правило, участвует ограниченное число животных, генотипы которых в значительной степени определяют генофонд породы в целом. Сохранению и поддержанию стабильной генетической структуры во многом способствует чистопородное и тем более чистокровное разведение животных, при этом периодическое прилитие свежей крови является вполне достаточным условием для поддержания внутрипородного генетического сходства особей.
Изучение аллельных частот маркерных генов позволяет определить генетические различия и степень генетического сходства пород, на которые влияют не только время раздельной эволюции, но и направление отбора (Храброва Л.А., 1980; Гурьев И.П., 1990; Дубровская Р.М. и др.. 1992; Sandberg, 1974; Nozawa e.a., 1976; Muller-Eckert e.a., 1999). Можно ожидать, что различия в генетической структуре скрещиваемых пород будут способствовать получению эффекта гетерозиса.
Изучение генетических особенностей лошадей заводских и локальных пород лошадей является основой для разработки методов генетического мониторинга в коневодстве. В нашей стране разводится целый ряд уникальных местных пород, практически неизвестных за рубежом - вятская, кузнецкая, мезенская, якутская и другие, многие из которых отнесены к породам с ограниченным генофондом. Лаборатория иммуногенетики института коневодства уже приступила к изучению генетической изменчивости местных пород лошадей с целью разработки методических рекомендаций по изучению и сохранению генофонда отечественных пород лошадей.
Основным методом совершенствования пород лошадей является разведение по линиям. Изучение генетической структуры основных заводских пород лошадей показало наличие четко выраженных межлинейных различий по наличию и частоте встречаемости отдельных аллелей исследуемых локусов (Стародумов И.М., 1974. 1996; Храброва Л.А, 1980; Понамарева Т.А., 1981, Лукаш Н.С., 1983; Шингалов В.А., 1984; Купцова Н.А. и др., 1999). Даже в наиболее тщательно отселекционированной породе с низким уровнем генетической изменчивости - чистокровной верховой - жеребцы-производители разных линий достоверно различались между собой по аллелям полиморфных систем крови (Храброва Л.А., Карелова А.Д., 2000). Это указывает, что традиционно высокий уровень племенной работы в коневодстве с индивидуальным подходом к вопросам подбора и отбора лошадей способствует созданию и поддержанию генеалогически и генетически разнородной, но в то же время консолидированной внутрипородной линейной структуры, являющейся основой для дальнейшего прогрессивного развития породы. Необходимо отметить, что разведение по линиям пока еще сводится к разведению по родословным. Как указывал Д.А. Кисловский (1965), большее или меньшее насыщение родословной кличками определенных животных не всегда соответствует их фактическому влиянию на пробанда, то есть обязательно необходимо принимать во внимание вероятностный характер коэффициентов, характеризующих степень генетического сходства на основании степени родства. Это подтверждает перспективность использования полиморфных систем крови и нуклеотидных повторов ДНК для маркирования генотипов выдающихся производителей и маток, что позволит не только контролировать процесс передачи генов родоначальника потомкам в ряде поколений, определять фактический индекс генетического сходства, но и прогнозировать эффективность подбора и отбора. По данным И.М. Стародумова (1996), анализировавшего передачу маркерных генов в двух линиях чистокровной верховой породы, потомки, унаследовавшие аллели родоначальника, имеют более высокую сумму выигрыша при испытаниях в гладких скачках.
Генетические маркеры также могут быть использованы для оценки результатов родственного разведения и контроля за уровнем гомозиготности у инбредных животных. На примере орловских и русских рысаков было показано, что увеличение степени инбридинга не всегда сопровождается увеличением гомозиготности инбредных лошадей (Храброва Л.А., 1980). Тенденция нарастания гомозиготности была отмечена только при близкородственном спаривании при коэффициенте инбридинга 4,0 и выше, на границе проявления инбредной депрессии (Рождестственгская Г.А., 1977). Контроль за уровнем гомозиготности и полиморфности особенно важен при разведении малочисленных локальных пород лошадей в маленьких замкнутых популяциях.
Поиски возможных связей аллелей и типов полиморфных системы крови с хозяйственно-полезными признаками были предприняты с самого начала исследований биохимического полиморфизма лошадей. Связь между аллельными генами и селекционируемыми признаками животных теоретически возможна через ряд генетических механизмов. Ген, контролирующий образование белка или фермента, в силу своего плейотропного действия может одновременно влиять и на формирование хозяйственно-полезного признака.
Плейотропное действие гена может проявляться и как результат вторичного влияния выработанного под его контролем белка на отдельные биохимические и физиологические процессы в организме животного. Ввиду постоянства такой связи прейотропный эффект представляет большую ценность для практической селекции. Маркерные гены могут находиться в одной группе сцепления с генами, определяющими хозяйственно-ценные признаки. Возможно также, что гетерозиготное состояние большинства полиморфных локусов, прямо или косвенно влияя на продуктивные качества животных, будет приводить к гетерозису.
В результате проведенных исследований И.М. Стародумов (1974) и А.С. Котов (1977) установили, что работоспособность лошадей чистокровной верховой породы зависит от имеющихся у них типов трансферрина и альбумина. К такому же выводу пришел В.А. Шингалов (1984) при изучении резвостных качеств русских рысаков. Но Н.С. Лукаш (1983) не подтвердила связей полиморфных белков крови с уровнем работоспособности скаковых лошадей. В исследованиях, проведенных Л.А.Храбровой (1980), была отмечена тенденция повышения резвости при увеличении частоты аллелей TfF и EsF у орловских рысаков и TfD, TfF, EsF и CaI у русских рысаков, но различия по группам лошадей были недостоверными. При изучении связи молочной продуктивности с иммуногеннетическими показателями крови кумысных кобыл было установлено (Новоселова К.С., 1997), что типы трансферрина, альбумина, эстеразы и системы эритроцитарных антигенов оказывают влияние на удой и содержание казеина в молоке и белковых фракций в сыворотке крови. Но разнотипный характер таких связей у кобыл разных пород, скорее всего, свидетельствует о "ложном сцеплении" маркерных генов с другими количественными признаками и временном характере таких связей. Такие корреляции могут быть постоянными в ряде поколений, если они поддерживаются отбором, подбором и закрепляются инбридингом. В любом случае даже временные связи маркерных генов с хозяйственно-полезными признаками могут быть использованы в племенной работе с конкретными популяциями животных.
Теоретическое положение о лучшей приспособленности гетерозиготных организмов получило убедительное подтверждение в работах многих исследователей. На разных породах лошадей было убедительно доказано, что увеличение степени гетерозиготности маток и потомства сопровождается повышением показателей воспроизводства кобыл (Дубровская Р.М. и др., 1976. 1978 1986; Храброва Л.А., 1980; Лукаш Н.С., 1983; Стародумов И.М., 1996). В.С. Кирпичников (1968) указывает, что внутрипопуляционный гетерозис всегда коррелирует с повышенной воспроизводимостью гетерозигот.
В современных условиях в связи с появлением большого числа частных коневладельцев, высокой стоимостью племенных животных, увеличением экспорта и импорта, а также внедрением биотехнологических методов необходимость надежной системы идентификации и контроля происхождения лошадей становится особенно актуальной. В соответствии с положениями о государственных племенных книгах обязательному тестированию подлежит все племенное поголовье лошадей чистокровной верховой, арабской, ахалтекинской, ганноверской, тракененской. орловской и русской рысистой пород. Общее число ежегодно типируемых по крови лошадей в нашей стране составляет 4-5 тысяч голов, во всем мире - 250 тысяч голов. Лаборатория иммуногенетики была организована в 1979 году с целью изучения генетических особенностей пород, идентификации и контроля происхождения лошадей. С 1983 года ВНИИ коневодства является членом Международного общества по изучению генетики животных (ISAG). За истекший период работы лабораторией иммуногенетики было протестировано свыше 80 тысяч лошадей заводских и местных пород. Систематическое тестирование всего поголовья лошадей основных заводских пород создает реальную основу для внедрения генетического мониторинга и других методов маркер-вспомогательной селекции в практику коневодства (Табл. 2).

Таблица 2
Стратегия использования маркер-вспомогательной селекции в коневодстве



В настоящее время по требованию Международного общества по изучению генетики животных (ISAG) большинство иммуногенетических лабораторий переходит на типирование ДНК. При контроле происхождения лошадей в качестве ДНК-маркеров как правило используют повторы динуклеотидных блоков (микросателлиты). При типировании микросателлитов ДНК применяют метод полимеразной цепной реакции, в основе которого лежит многократное увеличение копий детектируемого участка генома. Эффективность контроля происхождения лошадей при использовании 10-12 микросателлитов достигает 99,99%, что дает надежную гарантию решения спорных вопросов, связанных с происхождением лошадей. Генотипирование на уровне ДНК может быть использовано при диагностике наследственных заболеваний лошадей, таких как комбинированный иммунодефицит (SCID, severe combined immunodeficiencу disease), периодического паралича (HYPP, hyperkaliemic periodic paralysis) и некоторых других. Комбинированный иммунодефицит вызывается дефектом гена, координирующего взаимодействие лимфоцитарных антигенов. Гомозиготные по гену SCID жеребята гибнут в первые месяцы жизни. Скрытыми носителями этого гена являются 4-8% арабских лошадей, которых можно выявить только с использованием ДНК-технологии.
Важным аспектом практического использования иммуногенетического тестирования лошадей является профилактика гемолитической болезни жеребят, которая возникает в результате возникновения несовместимости между матерью и плодом по антигенам пяти систем крови: Aa, Ca, Da, Pa и Qa (подобно резус-фактору у человека). Вырабатываемые матерью антитела в норме не проникают через працентарный барьер и не причиняют вреда плоду. Жеребенок рождается вполне здоровым, но получаемые с молозивом матери антитела вызывают лизис эритроцитов и клинические признаки гемолитической болезни. Если не принять срочные меры развитие заболевания приводит к гибели жеребенка в первые дни после рождения. На основании результатов тестирования родительских пар по группам крови можно прогнозировать вероятность появления гемолитической болезни у ожидаемого приплода и проводить профилактическую корректировку будущих подборов.
В последнее время генетики и селекционеры все большее внимание уделяю картированию хромосом сельскохозяйственных животных. В 1995 году была начата разработка проекта по изучению генома лошади, и в течение нескольких последующих лет были получены впечатляющие результаты. В соответствии с намеченной стратегией исследований коллективами 14 лабораторий было проведено комплексное тестирование специально отобранной группы лошадей (гетерозиготных производителей и их потомков) по 162 маркерным генам, включая 145 микросателлитов ДНК, 10 полиморфных систем белков и ферментов крови и 7 систем эритроцитарных антигенов (Guerin e.a., 1998, 1999). Программный анализ выявил существенную связь между 124 локусами, которые образовали 29 групп сцепления. Идентифицированные синтенные группы были локализованы в 26 аутосомах лошади из 31, определяющих ее генотип. Определена общая длина генома лошади, составляющая 936 единиц рекомбинации. Можно ожидать, что начатая работа по изучению генома успешно завершится созданием генной карты хромосом лошади.